Iron Response ElementS

MÉTODOS, PROCEDIMIENTO Y RESULTADO

CONSTRUCCIÓN DE LOS PATRONES

Una vez tubimos todas las secuencias empezamos con la construcción de los patrones en forma de estructura secundaria. El procedimiento que seguimos es el que encontramos a continuación:

- Agrupamos todas las secuencias pertenecientes al grupo de ensayo para la misma proteína;

- Buscamos en cada secuencia el hexaloop descrito en la literatura como conservado a lo largo de todas las estructuras IREs (CAGWUN). Este se encontraba presente en casi todas las entradas en una posición media o central.

- Establecimos todas las complementariedades de bases los dos regiones flanqueantes al hexaloop. Los apareamientos permitidos fueron los clásicos (AóT and CóG) y también presentes entre GóT (se ha podido comprobar que a pesar de no tratarse de un apareamiento clásico se encuentra presente en un gran número de estructuras secundarias). Los patrones fueron construidos teniendo en cuenta que todas las secuencias debíamos encontrar a una distancia de 5' pares de bases upstream del hexaloop un bucle de tipo C o un bucle loop. En las secuencias de ferritina encontramos bucles de tipo loop mientra que en las transferrinas, eALAS y aconitasaas mitocondriales encontramos bucles C. Los patrones de las IRPs no pudieron construirse porque a pesar de que contaban con hexaloop, no encontrámos la complementariedad de bases esperada alrededor de éste.

El apareamiento de bases obtenido puede verse en los siguientes links:

- Grupo de ensayo (ferritina y transferrina más otras proteínas con elevada homología, 15 secuencias).

- Aconitasa (4 secuencias. El número original de secuencias era 10 pero estas como puede comprobarse eran una mezcla de secuencias UTR 5' y 3'. Todas las secuencias 3' no contenían el helaoop así que fueron descartadas para la construcción del patrón. Algunas de las entradas 5' al igual que las IRPs no se ceñian al patrón de los IREs puesto que no presentaban la complementariedad típica de bases a ambos lados del hexaloop y del bucle C. Éstas también fueron descartadas).

- Ferroportina (5 secuencias).

Tras esto nos dispusimos a construir el patrón consenso para cada grupo de proteínas. Éste fue construido mirando la conservación nucleotídica a lo largo de las posiciones del hexaloop, los cinco nucleótidos upstream del hexaloop, el bucle medio y todos aquellos nucleótidos con complementariedad a ambos lados del mRNA. Hemos de decir que puesto que la ferritina del mosquito de la fiebre amarilla no cumplía la estructura general de las ferritinas no fue considerada para la construcción del patrón (esta contiene un bucle C en lugar de un bucle loop). El patron lineal obtenido fue el siguiente:

                                    Segmento 1     Loop medio   Segmento  2        Hexaloop

- Ferritina:                  Y             TAC        WDMVD       CAGTAH

- Transferrina:        WKTAT          C            RGDRR       CAGWAH

- Aconitasa:            YAT             C             TTTAT         CAGWAH

- Ferroportina:       AACTT          C            RGCTA        CAGTGW 

Los patrones, para poder ser reconocidos con Patscan (un programa capaz de buscar un motivo concreto a lo largo de una secuencia) debían estar en la forma adecuada para poder ser reconocidos por el sistema (simulando la estructura secundaria). Fue por ello que tuvimos que modificar los patrones en base a las reglas o normas especificadas por Patscan (http://www-unix.mcs.anl.gov/compbio/PatScan/HTML/patscan.html).

Clickar en el siguiente link para obtener los nuevos patrones

En este punto ya fuimos capaces de correr todos los patrones sobre las secuencias que habíamos extraído. Antes de esto recogimos un total de 40 secuencias (20 secuencias de la región 5' UTR y otras 20 de la 3' UTR) cuyos mRNA no contuvieran IREs. Corriendo los patrones generados no sólo sobre las secuencias que nos interesaba testar (secuencias con IREs) sino también sobre éstas, podríamos determinar como de estricto los patrones eran.

Clickar en el siguiente link para obtener las secuencias carentes de IREs

Corrimos el patrón de estructura secundaria de la ferritina sobre el grupo de secuencias de ensayo, el grupo de secuencias test y sobre las secuencias carentes de IREs 5' y 3' (clickar aquí para obtener los comandos Perl necesarias para correr el programa Patscan). El patrón reconoció del grupo de secuencias de ensayo un total de 7 secuencias (6 ferritinas y la succinato dehidrogenasa), del grupo de secuencias test 7 secuencias (toda ellas ferritinas, pero excluyó una de la Drosophila) y ninguna en los ficheros 5' y 3' para mRNAs sin IREs.

El patrón de la transferrina reconoció (clickar aquí para obterner los comandos) en el grupo de secuencias de ensayo 5 secuencias, en el grupo test 4 secuencias y igual que antes, ninguna en las entradas para mRNAs sin IREs.

Cuando corrimos el patrón de la aconitasa sobre el conjunto de secuencias original (el que contenía las 10 secuencias),  5 secuencias fueron reconocidas (clickar aquí para obtener los comandos). Todas ellas eran las utilizadas para la construcción del patrón. Tampoco aquí encontramos ninguna secuencia perteneciente a los mRNAs carentes de IREs.

El patrón de la ferroportina cuando fue pasado sobre las secuencias correspondientes (clickar aquí para obtener los comandos) nos devolvió  4 secuencias. Una única secuencia de las originales, la perteneciente a Dario rerio, no fue encontrada.

Como puede comprobarse por estos resultados, todos nuestros patrones son muy estrictos puesto que discriminan de una forma muy específica las diferentes isoformas de IREs. Resumiendo, tan solo somos capaces de reconocer los mRNAs pertenecientes a la familia de proteínas para los cuales el patrón está destinado.