Discussió

A partir de l'anàlisi dels resultats hem trobat un total de 23 selenoproteïnes en Ailuropoda melanoleuca, de les quals comentarem els aspectes més rellevants i les dificultats que hem tingut en cada cas durant el procés de cerca de selenoproteïnes.

TAULA 4.
Quadre resum

Proteïnes Mus musculus Homo sapiens Ailuropoda melanoleuca
DI1 sí sí sí

DI2 sí sí sí

DI3 sí sí sí

GPx1 sí sí sí

GPx2 sí sí sí

GPx3 sí sí sí

GPx4 sí sí sí

GPx6 NO sí sí

TR1 sí sí sí

TR2 sí sí sí

TR3 sí sí sí

Sel15 sí sí sí

SelH sí sí sí

SelK sí sí sí

SelM sí sí sí

SelN sí sí sí

SelI sí sí sí

SelO sí sí sí

SelP sí sí sí

SelR1 sí sí sí

SelT sí sí sí

SPS2 sí sí sí

SelS sí sí NO

SelV sí sí ?

SelW1 sí sí sí

TOTAL 24 25 23

TAULA 4. Quadre resum
Proteïnes	Mus musculus	Homo sapiens	Ailuropoda melanoleuca
DI1	sí	sí	sí
DI2	sí	sí	sí
DI3	sí	sí	sí
GPx1	sí	sí	sí
GPx2	sí	sí	sí
GPx3	sí	sí	sí
GPx4	sí	sí	sí
GPx6	NO	sí	sí
TR1	sí	sí	sí
TR2	sí	sí	sí
TR3	sí	sí	sí
Sel15	sí	sí	sí
SelH	sí	sí	sí
SelK	sí	sí	sí
SelM	sí	sí	sí
SelN	sí	sí	sí
SelI	sí	sí	sí
SelO	sí	sí	sí
SelP	sí	sí	sí
SelR1	sí	sí	sí
SelT	sí	sí	sí
SPS2	sí	sí	sí
SelS	sí	sí	NO
SelV	sí	sí	?
SelW1	sí	sí	sí
TOTAL	24	25	23

Familia DI: Iodothyronine deiodinase

Aquesta família de proteïnes es troba força conservada en vertebrats i més concretament en mamífers. La seva funció principal consisteix en la regulació de l'activació i la inactivació de la hormona tiroides. Inclou almenys tres selenoproteïnes conegudes en mamífers: DI1, DI2, DI3. Totes tenen un domini tioredoxina i mostren una homologia intrafamiliar important.

En el nostre anàlisi hem cercat si aquestes tres selenoproteïnes es troben conservades en Ailuropoda melanoleuca. En tots els casos hem trobat una selenocisteïna amb els programes exonerate i genewise. A partir de l'alineament observat amb el programa TCOFFEE hem vist una elevada conservació de les tres proteïnes respecte els seus ortòlegs en Homo sapiens. Per altra banda, els nostres resultats concorden amb els obtinguts amb el Selenoprofiles.

A més a més, hem trobat elements SECIS en al regió 3'UTR de DI2 i DI3, mentre que en el cas de DI1 no en trobem. Tot i així, podem concloure que les tres proteïnes analitzades (DI1, DI2 i DI3) són selenoproteïnes conservades en Ailouropoda melanoleuca, degut a l’elevada homologia de les seqüències.

Jalviews: DI1, DI2 i DI3

Família GPx: Glutathione peroxidase

Es tracta de la família de proteïnes que conté un major nombre de selenoproteïnes descrites amb una alta identitat nucleotídica. En mamífers trobem vuit homòlegs, dels quals GPx1-4 i GPx6 són selenoproteïnes. Cal destacar, però que GPx6 es considera un homòleg amb cisteïna en Mus musculus, segurament degut al canvi aminoacídic de la selenocisteïna ancestral per una cisteïna.

Els nostres resultats ens indiquen que GPx1, GPx2, GPx3 i GPx4 són selenoproteïnes conservades en Ailuropoda melanoleuca, ja que hem trobat una selenocisteïna i l'element SECIS en cadascuna d'elles. En el cas de GPx4 no hem trobat SECIS, tot i que segons diversos estudis és una de les selenoproteïnes més conservades. No obstant, degut a l’elevada homologia observada en els diversos alienaments realitzats, podem dir que també és una selenoproteïna en l’ós panda.

Pel que fa a GPx6 hem tingut algunes complicaicons. Incialment, en comparar el genoma de l’ós panda amb el de l’humà, els programes exonerate i el genewise ens donaven resultats contradictoris. De manera que amb el programa exonerate ens alineava la selenocisteïna d’Homo sapiens amb una cisteïna en Ailuropoda melanoleuca, mentre que amb el genewise ens apareixia conservació de la selenocisteïna en les dues espècies. Un fet similar ens passava a l’hora d’analitzar la GPx5, que és un homòleg amb cisteïna en Homo sapiens. Ens vam adonar que tot i que l’scaffold analitzat amb els dos programes era el mateix, les regions on tenia lloc l’alineament implicaven diferents exons i el fastasubseq incloïa les dues proteïnes, de manera que vam hipotetitzar que podria ser que GPx6 i GPx5 tinguessin una estructura molt similar, fet que vam comprovar alineant les dues seqüències aminoacídiques de GPx6 de l’exonerate i del genewise amb el programa TCOFFEE. A més, també era coherent pensar que es trobessin properes, en el mateix scaffold del genoma de l’ós panda, de manera que l’exonerate ens identifiqués GPx5 i GPx6 com a homòlegs amb cisteïna, mentre que el genewise ens sortia GPx6 i GPx5 com selenoproteïnes. Per tal de discernir quina proteïna era en cada cas, vam fixar-nos en les regions de cada alineament i vam veure com l’exonerate de GPx6 (Unk-Cys) es corresponia amb la mateixa regió que l’exonerate de GPx5 (Cys-Cys), el cas invers passava amb genewise. A més vam fer la comparació amb Mus musculus i en aquest cas l’exonerate sí que ens identificava la GPx6 com a selenoproteïna, confirmant les nostres sospites de que GPx6 realment és una selenoproteïna en l’ós panda, mentre que GPx5 és un homòleg amb cisteïna.

Per últim, hem volgut analitzar els homòlegs amb cisteïna GPx7 i GPx8. Els resultats mostren que tan GPx7 com GPx8 també són homòlegs amb cisteïna en Ailuropoda melanoleuca, perquè trobem conservació de cisteïna i no hi ha element SECIS a la regió 3'UTR.

Jalviews: GPx1, GPx2, GPx3, GPx4 i GPx6

Família TR: Thioredoxin reductase

La funció d’aquestes proteïnes és controlar l’estat redox de les tioredoxines. En mamífers trobem tres isoenzims: TR1 (citosòlic), TR3 (mitocondrial) i TGR. A partir d’anàlisis filogenètics s’ha postulat que TGR i TR1 de mamífers han evolucionat per duplicació de la proteïna TR1 ancestral de peix, fet que es va observar per primer cop en amfibis.

Nosaltres hem analitzat si els membres d’aquesta família, caracteritzats com a selenoproteïnes en la base de dades del selenoDB, es troben conservats en l’ós panda.En els tres casos (TR1, TR2, TR3) veiem una selenocisteïna amb el programa exonerate, després de blastejar el genoma d’Ailuropoda melanoeuca contra el genoma d’Homo sapiens. A més trobem un element SECIS a la regió 3’UTR. Així doncs, hipotetizem que és possible es tracti de les selenoproteïnes conservades en ós panda.

Jalviews: TR1, TR2 i TR3

Sel15, SelK, SelH, SelM, SelN

Pel que fa a la resta de proteïnes analitzades hem trobat que sel15, selK, selM, selN i selH són selenoproteïnes conservades en A. melanoleuca, ja que trobem presència de selenocisteïna cofidicada pel codó UGA i també tenen elements SECIS en la regió 3’UTR, excepte en el cas de selH.

SelI

És de les selenoproteïnes menys estudiades. SelI té 7 dominis transmembrana predits i un domini CDP-alcohol fosfatidiltransferasa altament conservat. Comparteix amb els seus homòlegs un centre actiu molt conservat. A més, s’ha observat que la cys 133 és una candidata per un enllaç selenilsulfit amb Sec. En el nostre cas trobem una selenocisteïna amb el programa exonerate i a més hem trobat un element SECIS en la regió 3'UTR. Per tant deduïm que també és una possible selenoproteïna en Ailuropoda melanoleuca.

SelO

La selO és selenoproteïna que té dues isoformes conservades en ratolins, rates i humans. Un fet a destacar és que en l’apical loop de l’element SECIS d’aquesta selenoproteïna hi ha dues citosines enlloc de dues adenines, com la selM, a diferència de tota la resta de selenoproteïnes, fet que només succeeix en mamífers. En aquest cas trobem una selenocisteïna i el TCOFFEE ens dóna un alineament molt bo però no hem trobat elements SECIS. Tot i així, com que hi ha força conservació aminoacídica podem dir que molt probablement també és una selenoproteïna en Ailuropoda melanoleuca.

SelP

Aquesta selenoproteïna té un número variable de residus de selenocisteïna i és la única que que està regulada per dos elements SECIS, sempre localitzats en el mateix exó a la regió 3’UTR en vertebrats, amb una separació de 334 nucleòtids aproximadament.

Es troba en Homo sapiens, i té deu selenocisteïnes. Després de la nostre anàlisi, observem que en el genoma de l'ós panda no només hi ha les deu selenocisteïnes, sinó que n'observem de noves: veiem tres cisteïnes i una arginina presents a l'Homo sapiens, que en l'Ailuropoda melanoleuca es correspondrien amb quatre selenocisteïnes noves. Així doncs, hem consultat la base de dades dbTEU per tal de veure si espècies properes a Ailuropoda melanoleuca, com ara Bos taurus o Canis lupus familiaris també tenen més selenocisteïnes que Homo sapiens. En el cas de Bos taurus trobem 12 selenocisteïnes, de manera que és raonable que l’ós panda en tingui 14 en el seu genoma.

A més, observem que té dos elements SECIS, així doncs, podem concloure que es tracte d'una selenoproteïna.

Methionine-R-sulfoxide reductase 1: selR1, R2, R3

SelR1 és una selenoproteïna conservada en vertebrats, tant en Mus musculus i Homo sapiens, com en Ailuropoda melanoleuca. Aquesta conlusió l’hem extret dels resultats que mostren presència de selenocisteïna en el genoma de l’ós panda i dos elements SECIS a la regió 3’UTR. Per altra banda, podem dir que selR2 i selR3 són homòlegs amb cisteïna enlloc de selenoproteïnes. Aquests resultats concorden amb els obtinguts a partir del Selenoprofiles.

SelT

A partir dels resultats de l’exonerate i del genewise veiem com selT té una selenocisteïna conservada en Ailuropoda melanoleuca. A més hem trobat que té un element SECIS a la regió 3’UTR, fet que ens permet establir que es tracta d’una selenoproteïna conservada en l’ós panda. Els resultats del Selenoprofiles també corroboren les nostres conclusions. A més a més, diversos estudis estableixen que la selenoproteïna més conservada és la SelT, molt semblant en tots els mamífers (fins i tot a nivell nucleotídic).

SelU1, U2, U3

Anàlisis filogenètics mostren que en mamífers tots els membres d’aquesta família (selU1,2,3) són homòlegs amb cisteïna. A l’hora d’analitzar-les en el genoma de l’ós panda, hem pogut comprovar com es troben molt conservades i no tenen elements SECIS. Per tant, podem concloure que selU1, selU2 i selU3 són homòlegs amb cisteïna en A. Melanoleuca.

SelW2

Pel que fa a selW2, veiem conservació de cisteïna, ja que es tracta d’un homòleg amb cisteïna tan en Mus musculus com en Homo sapiens. A més, dos elements SECIS. Podem dir que en l’ós panda és un homòleg amb cisteïna tot i tenir elements SECIS.

MsRA: Methionine Sulfoxide Reduction

Es tracta d’una proteïna relacionada amb la reducció dels sulfòxids de metionina. En aquest és un homòleg amb cisteïna. Hem volgut comprovar si també ho és en l’ós panda.
Els nostres resultats mostren la conservació de la cisteïna i a més trobem que té dos elements SECIS. Això pot ser degut a que inicialment era una selenoproteïna que ha evolucionat i ha canviat la U per una C, però encara no ha tingut temps de perdre la maquinària.

Maquinària

Eukaryotic elongation factor (eEFSec) i SECIS binding protein 2 (SBP2)
Es tracta de proteïnes molt conservades en vertebrats i que formen part de la maquinària de biosíntesis de les selenoproteïnes. En ambdós casos veiem un alineament molt conservat amb el programa TCOFFEE (tan a partir de l’exonerate com del genewise). Podem concloure doncs, que en el genoma de l’ós panda s’han conservat al llarg de l’evolució aquestes proteïnes de maquinària.

PSTK, SLA/LP, SECp43
Aquestes proteïnes formen part de la maquinària de biosíntesi però no són selenoproteïnes, de manera que la seva seqüència aminoacídica no està anotada a la base de dades del SelenoDB. Per tant, hem consultat l'Ensmbl per poder fer el blast de les proteïnes d'Homo sapiens contra el genoma de l'ós panda. Els resultats mostren una elevada conservació tan en PSTK com en SLA/LP i en SECp43, fet que ens indica que la maquinària està conservada en Ailuropoda melanoleuca.

Selenophosphate synthetase: SPS1, SPS2
SPS1 és un homòleg amb treonina en Homo sapiens i Mus musculus. Tot i així, hem volgut determinar si també és un homòleg en A. Melanoleuca. Els nostres resultats ens van indicar en un primer moment, que es tractava d’una selenoproteïna, ara bé, tenint en compte que no ho són ni en Homo sapiens ni en Mus muculus, l’analitzem amb més detall i ens adonem que hem trobat la selenoproteïna SPS2. Així doncs podem concloure que SPS1 no es tracta d’una selenoproteïna.SPS2 és una selenoproteïna conservada en vertebrats que a més forma part de la maquinària de biosíntesis. La seva funció és generar el component donador de Se, necessari per la biosíntesi de Sec.

En relació amb l’evolució d’aquesta selenoproteïna en mamífers, inicialment SPS1 apareixia com a un gen multiexònic (SPS2a), després va ser substituït per un gen amb un únic exó (SPSb), que és el que es troba a mamífers placentaris. Les dues proteïnes tenen elements SECIS. Mentre que els marsupials conserven els dos, la resta de vertebrats només la primera versió. No es té prou informació si les dues són actives. Els resultats indiquen que la SPS2b va aparèixer per transcripció reversa.
Després d’analitzar SPS2, hem trobat una selenocisteïna i dos elements SECIS, de manera que podem pensar que es tracta d’una selenoproteïna conservada en A. melanoleuca. A més els resultats del selenoprofiles ens confirmen les nostres sospites.

Casos dubtosos

SelS
Aquesta proteïna intervé en el procés de degradació de proteïnes mal plegades del reticle endoplàsmic (Homo sapiens) (Uniprot).
La selS és un cas curiós en l'ós panda. En fer l'exonerate i el genewise trobem selenocisteïnes en el genoma d'Ailuropoda melanoleuca que es troben alineades amb altres aminòacids en Homo sapiens. En concret, veiem tres canvis aminoacídics: G per X, L per X i W per X. Tot i així observem que que hi ha diversos canvis de frame (frameshifts). Així doncs, podem pensar que aquests canvis d'aminoàcid són possibles falsos positius i que selS ha esdevingut una copia no funcional en Ailuropoda melanoleuca i que, per tant, és tractaria d’una proteïna codificada per pseudogen i no una selenoproteïna.

SelV, selW1
SelV és la selenoproteïna menys conservada trobada en mamífers i es pensa que es pot haver originat d’una duplicació probable del gen SelW. No se sap la funció de cap de les dues, però la selV es troba expressada només en testicles, mentre que la selW la trobem en diferents òrgans. Tenen la mateixa estructura exònica amb canvis significatius a l’exó 1 i a l’exó 6.

S’ha descrit a la literatura que la selV s’ha perdut per del·leccions en goril·la. Pel que fa a la selW, té homòlegs en altres espècies com selW2, en algun tauró i en granota, indicant que formaria part de l’ancestre dels vertebrat. En mamífers l’homòleg de selW és Rdx12 (no selenoproteïna), i també es troba a la granota (juntament amb SelW2).

En els dos exonerates es poden apreciar la selenocisteïna (Unk) del genoma d’Homo sapiens alineada amb una prolina en el genoma d’Ailuropoda melanoleuca. Per altra banda, trobem elements SECIS tant per selW1 com en selV. Això ens va dur a pensar que és possible que en l’ós panda s’hagin perdut aquestes selenocisteïnes. Per tal d’explicar aquest fet, vam formular dues hipòtesis. Per una banda, tenint en compte que selV ha esdevingut d’una duplicació a partir de selW, era probable que el canvi de selenocisteina a prolina s'hagués donat en la proteïna ancestral. En segon lloc, era possible que posteriorment a la duplicació la selenocisteïna d'ambdues proteïnes mutessin per esdevenir una prolina. Vam arribar a la conclusió que era més probable que el canvi d'aminoàcid s'hagués produït abans de la duplicació, ja que dos canvis de selenocisteina a prolina com a successos independents tenien una probabilitat remota de ocórrer.

No obstant, vam desestimar aquestes hipótesis. En el cas que el canvi per prolina fós anterior a la duplicació, hauríem d'observar aquestes prolines en les selW1 i selV d'altres organismes. Ambdues proteïnes són selenoproteïnes en Homo sapiens, per tant el nostre plantejament era improbable de ser cert. Seguidament, vam pensar en un altre esdeveniment genòmic que podia haver generat aquesta situació. SelW1 podria haver mutat la seva selenocisteïna a una prolina i mitjançant una segona duplicació (partíem de la premissa que selW1 ja s'havia duplicat per formar selV) havia originat una regió similar a selV. D'aquesta manera, els nostres resultats estaven confonent selV per una duplicació de selW1 que havia heretat la prolina en qüestió.

Malgrat aquest fil de raonaments, un anàlisi més exhaustiu dels resultats ens va fer plantejar una altre situació possible.

Per tal de comprendre perquè no trobavem la selenocisteïna de selW1, vam recórrer als resultats del blast. Vam veure que hi havia un altre scaffold amb hits significatius. Per tant, vam procedir a fer tot l'anàlisi de nou. Vam observar com en aquest cas si que detectavem la selenocisteïna de selW1 humana. Tenint l'alta qualitat de l'alineament per TCOFFEE en els dos scaffolds, pensem que és possible que selW1 s'hagi duplicat en el genoma de l'ós panda.
TCOFFEE1 TCOFFEE2

Per altra banda, el TCOFFEE de selV mostra molt poca conservació de la proteïna d'Ailuropoda melanoleuca respecte la d'Homo sapiens i de Mus musculus.
De fet, creiem que és possible que la selV s'hagi deleccionat en el genoma de l'ós panda d'una manera semblant als goril·les.

No obstant, el selenoprfiles identifica una regió del genoma d'Ailuropoda melanoleuca que pot codificar per selV i que conté una selenocisteïna. Tot i intentar reiteradament l'anàlisi no hem aconseguit obtindre uns resultats equiparables als del selenoprofiles. Per tant, també contemplem la possibilitat que selV es trobi en el genoma de l'ós panda, patint nombroses modificacions a nivell de seqüència.

Per acabar, doncs, podem hipotetitzar el següent:

1. És probable que selW1 s'hagi duplicat en el genoma de l'ós panda i una de les còpies resultants hagi modificat la selenocisteïna per una prolina.
2. Possiblement selV es troba en Ailuropoda melanoleuca, malgrat que no està gaire conservada respecte els seus ortòlegs en espècies properes filogenèticament.

Jalviews: SelV