GPx 1-8
La funció de la familia glutatione peroxidase (GPx) és la detoxificació del peròxid d'hidrogen. El gen és altament expressat en el ronyó, jugant un paper important en la protecció vers el dany oxidatiu. Es varen descobrir varis transcrits que codifiquen per diferents isoformes o subfamílies. En humans es coneixen 8 subfamílies, de les quals tres contenen un residu de selenocisteïna al seu centre actiu. Hem realitzat un tBLASTn del nostre genoma contra totes les subfamílies GPx (1-8) de les espècies Homo sapiens i Mus musculus, ja que aquestes, a diferència de les altres espècies, presenten totes les subfamílies conegudes. El resultat del tBLASTn mostra que el hit més significatiu correspon a l'alineament de la query corresponent a la seqüència proteica GPx de H. sapiens.
Hem realitzat un tBLASTn de les subfamílies de GPx (1-8) de H. sapiens contra el nostre genoma de L. braziliensis amb les opcions -m 9, que ens proporcionen major informació respecte l'alineament. A continuació, es mostren els resultats.
Analitzant els resultats, veiem que hi ha quatre hits significatius en cada una de les subfamílies GPx. Cada un d'aquests hits es correspon a un alineament de la GPx amb diferents regions del genoma (observar com la query start/ query end coincideixen i, en canvi, la subject start/ subject end difereixen). Això ens pot fer pensar que existeixen repeticions de GPx en diferents regions del genoma o, simplement, que es tracta d'un error en realitzar el fastaindex.
Per a comprovar-ho, hem escollit de cada regió alineada el hit més significatiu d'entre totes les subfamílies GPx. Realitzant això s'observa com els hits més significatius de tres de les quatre regions alineades corresponen a la subfamilia GPx4 i es localitzen al mateix contig "gi|154339612|ref|NC_009318.1|". El millor hit de la regió restant correspon a la subfamilia GPx7 i es localitza en un contig diferent, "gi|154346825|ref|NC_009327.1|". En la següent figura, es mostren encerclades les dades a partir de les quals hem realitzat la predicció de les proteïnes:
Cada una de les proteïnes predites, les anomenarem GPx regió 4.1, GPx regió 4.2, GPx regió 4.3 i GPx regió 7. Per a cada una de les regions mencionades alineades en el tBLASTn, hem realitzat el protocol que seguidament s'explica. Finalment, per a observar si les proteïnes predites a partir d'aquestes regions eren duplicacions o eren un artefacte, hem fet un alineament múltiple entre elles:
L'alineament múltiple ens mostra com existeix quasi un 100% de similaritat entre aquestes proteïnes predites. Aquest fet ens permet arribar a la conclusió de que es tracta d'artefactes, ja que si fossin diferents duplicacions de GPx no existiria un 100% de similaritat. Fins i tot, la proteïna predita a partir de la regió 7 que es troba en un contig diferent sembla ser un artefacte, ja que s'alinea al 100% amb les altres. Tanmateix, s'ha realitzat un T-COFFEE d'aquesta última amb cada una de les subfamílies GPxs per a determinar a quina s'assemblava més, i va donar com a resultat que era més similar a la GPx4.
Per tant, considerem que solament existeix una GPx de la subfamilia GPx4 en L. braziliensis corresponent al hit més significatiu de la GPx4 de H.sapiens obtingut en el tBLASTn inicial.
Gpx4
Escollim l'alineament que es localitza en "gi|154339612|ref|NC_009318.1|", amb un E-value de 7e-29 i score de 123. A més a més, en el tBLASTn d'aquest hit, s'observa com ens alinea una selenocisteïna de H. sapiens amb una cisteïna de L. braziliensis:
Tot seguit, hem procedit a extreure la seqüència genòmica d'interès localitzada al contig "gi|154339612|ref|NC_009318.1|", on s'havia produit l'alineament.
A partir d'aquesta regió, hem determinat la seva estructura gènica, és a dir, els exons i els introns presents en aquesta subseqüència. Això ho obtenim gràcies al programa Genewise, el qual ens alinea aquesta subseqüència juntament amb la GPx4 de H. sapiens i ens localitza els exons i els introns. Els resultats es mostren a continuació.
A partir d'aquí, hem agafat el cDNA predit pel programa Genewise i hem realitzat un fastatranslate per tal d'obtenir els 6 possibles ORFs. Per tal de determinar quin d'aquests corresponia a la possible seqüència codificant de la selenoproteïna, hem realitzat un BLASTp entre els diferents ORFs contra la proteïna GPx4 de H. sapiens. Llavors, hem extret la seqüència proteica a partir del millor hit obtingut per BLASTp. Aquesta presenta un E-value de 1e-33 i un score de 123. A continuació es mostra la seqüència proteica predita corresponent a la GPx regió 4.1 de L. braziliensis:
>subseq(228880,6461).[3001:3462].sp [translate(1)] SIYDFQVKDSDHQPYNLSQHKGHPLLIYNVASKC GYTKSGYETATTLYEKYKGRGFTVLAFPCNQFAHQE PGTEAEVKTFACTRFKANFPIMEKVNVNGEKEHPLYCYLKNACKGILGTTLVKWNFTSFLVDKDGHAVHR FPPGATVEEIEKKL
Analitzant la seqüència veiem que presenta un C en posició 34, indicatiu de que possiblement la nostra predicció es tracti d'una homòloga de cisteïna.
Per acabar de confirmar les nostres sospites, hem realitzat un SECISearch, amb el que hem obtingut una predicció d'estructura SECIS, tot i que no presenta un valor de COVE score molt alt (1,62).
També hem realitzat per mitjà dels programes Interpro i Pfam, una cerca de dominis proteics, amb la qual vam localitzar el domini característic de la Glutathione peroxidasa (GSHPx).
Finalment hem realitzat un alineament múltiple amb les diferents espècies que presentaven GPx4 per tal de veure si havia conservació entre elles.
Els resultats demostren que la selenocisteïna es troba conservada en H. sapiens i M. muculus, mentre que en D. melanogaster, T. brucei, L. major i L. braziliensis s'alinea amb una cisteïna (homòlegs de cisteïna).
