> Per a la realització d'aquest treball, considerarem tots els servidors web i eines de visualització utilitzats:

• Servidors Web:

  • NCBI
    
  • BLASTN
    
  • TBLASTX
    
  • ClustalW
    
  • Interpro
    
  • Promo
    
  • TRANSFAC
    
  • Zpicture
    
    

• Eines de visualització

  • gff2ps
    
  • gff2aplot
    
    • parseblast (aquest programa forma part del gff2aplot.)
  • fastachunk
  • gb2gff

MÈTODE:

1. Investigació i identificació dels bacteris capaços d'infectar plantes a través de les regions T-DNA dels seus plàsmids, i a partir d'aquestes establir una filogènia.
   
   
2. Cerca de les seqüències que continguin el gen ORF8 del T-DNA de pRi2659 en el seu genoma.
   
   Aquests plàsmids i bacteris són el resultat de realitzar diferents BLASTN i TBLASTX a partir de la seqüècia nucleotídica del T-DNA del plàsmid Ri2659.
   Donat que el nombre de seqüències obtingudes amb aquest mètode no era suficient, vam ampliar la cerca. Per tal de fer-ho vam repetir ambdós tipus de BLAST amb els resultats dels BLASTS anteriors.
   
   
3. Realització d'un BLAST local entre el pRi2659 i totes les altres seqüències trobades.
   
   
4. Amb el resultat del BLAST local, canviem el format per poder visualitzar l'alineament. Això es fa mitjançant els programes parseblast, gb2gff i GFF2APLOT
   
   
5. Les seqüències que tenim en format text de genbank les sotmetem al programa gb2gff. Amb això obtindrem una taula que conté la informació corresponent a la posició d'on comença i acaba el gen així com si és reverse o forward.
   A continuació, el contingut d'aquesta taula es transforma a format ps. Tot seguit, a través del programa gff2aplot, enfrontem el T-DNA del 2659 amb cadascuna de les altres seqüències. El resultat de l'aplicació d'aquest programa es una gràfica que mostra les diagonals conservades, d'on intentarem deduïr si hi ha conservació de l'orf8 amb algun dels gens dels altres genomes i poder determinar si es tracta de possibles gens homòlegs.
   
   
6. Creació i correcció del mapa genètic dels plàsmids per tal de fer que els possibles gens homòlegs a orf8 quedin ajustats per tal de facilitar la posterior anàlisi de la informació obtinguda. Això ho vam aconseguir obtenint els millors hits per extraure les seves coordenades mitjes, amb el petit script en perl getY0. Un cop aconseguides les coordenades i aplicant la comanda gawk obtenim les correccions desitjades. Repetim el procés per totes les seqüències. Amb totes les seqüències corregides més la seqüència corresponent al T-DNA de pRi2659, aconseguim el format ps que serà el que visualitzarem.
   
   
7. Realització d'un alineament múltiple de les seqüències mitjançant el programa clustawl.
   
   
8. Execució del programa Zpicture amb les seqüències tant sintèniques com intergèniques de tots els gens d'estudi per tal de diferenciar les regions codificants de les no codificants. Aquest resultat ens permetrà, per tant, veure si les nostres seqüències comparteixen el mateix promotor.


9. Cercar la funció dels dominis putatius a través del programa INTERPRO.
   
   
10. Aplicació del programa fastachunk que ens permet agafar 500 parells de bases upstream del nostre gen per tal de trobar els seus factors de transcripció a través de la base de dades TRANSFAC.
    
    
11. Per tal d'assegurar-nos que no ens hem deixat cap proteïna es realitza un BLASTP a partir de l'ORF8 del pRi2659.
    
    
    
    

Home   Introducció   Materials/Mètodes   Resultats   Discussió   Referències