El càncer ha esdevingut en els darrers anys una de les patologies amb més incidència en la societat occidental. Un dels principals camps d'investigació en la biomedicina és l'enfocat al diagnòstic i tractament del càncer. El desenvolupament tecnològic i el de la biologia molecular ha permès obtenir diverses eines de diagnòstic. Entre aquestes destaquem la tècnica de DNA microarrays, la qual permet caracteritzar l'expressió diferencial de gens en teixits tumorals podent, d'aquesta manera, extraure conclusions sobre quins són els gens implicats en la malaltia. Aquesta caracterització d'expressió gènica possibilita un diagnòstic fiable i relativament ràpid. D'altra banda, el coneixement d'aquests gens/proteïnes obre les portes a nous tractaments.

En el nostre projecte estudiarem l'expressió gènica diferencial en els diversos estadis del càncer de bufeta. Basant-nos en dades de DNA microarrays i emprant diverses eines informàtiques buscarem:

• Gens amb una expressió diferencialment significativa.
• Funció dels principals gens implicats en cada estadi del tumor.

Per dur a terme el nostre estudi ens hem basat en dos papers:

• Gene Discovery in Bladder Cancer Progression using cDNA Microarrays. Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Lozano JJ, Li W, Charytonowicz E, Belbin TJ, Prystowsky MB, Ortiz AR, Childs G, Cordon-Cardo C. Am J Pathol. 2003 Aug;163(2):505-16.
  
  En aquest article s'identifiquen els canvis en l'expressió de gens a través de la progressió del càncer de bufeta utilitzant cDNA microarrays. Mitjançant clustering jeràrquic van obtenir una classificació inicial de l'estadi primerenc versus estadi invasiu, diferenciant entre carcinomes in situ i lesions superficials papil.lars. Reconegueren que els tumors dels estadis més primerencs presentaven perfils gènics similars als invasius. Per tal d'indentificar gens rellevants involucrats en la progressió del càncer de bufeta van utilitzar diferents tècniques estadístiques com per exemple el t-test. Això els va permetre identificar patrons d'expressió relacionats amb l'estat patològic i obtenir la rellevància d'alguns gens i vies de senyalització al llarg de la progressió del càncer. En aquest estudi es pretén identificar marcadors moleculars potencialment útils pel diagnòstic i tractament clínic.
  
  
• Identifying distinct classes of bladder carcinoma using microarrays. Dyrskjot L, Thykjaer T, Kruhoffer M, Jensen JL, Marcussen N, Hamilton-Dutoit S, Wolf H, Orntoft TF. Nat Genet. 2003 Jan;33(1):90-6. Epub 2002 Dec 09.
  
  En aquest article s'intenta identificar les diferents subclasses de càncer de bufeta utilitzant anàlisi d'expressió en microarrays. Mitjançant clustering jeràrquic van classificar en tres grans estadis la progressió del càncer: Ta, T1, T2-4. També van diferenciar els tumors Ta no-recurrents dels recurrents. Grups funcionals de gens, la regulació dels quals conté les bases per la classificació del tumor de bufeta en superficials-invasius, foren identificats. Els perfils d'expressió gènica característics de cada estadi els donaren la possibilitat d'identificar les propietats biològiques de cada grup oferint potencials dianes terapèutiques.

Obtenció de la base de dades. Per trobar la bases de dades de microarrays que van fer servir en l'article citat anteriorment "Identifying distinct classes of bladder carcinoma using microarrays" vam accedir a Gene_Expression_Omnibus (GEO) a partir de la web del NCBI.

El set de dades Bladder tumor stage classification de canal simple és la corresponent al paper. A continuació vam seleccionar les mostres dels estadis tumorals Ta, T1 i T2+.

Selecció de valors d'expressió significatius. En aquest pas vam fer l'estudi estadístic basat en R-script en una web proporcionada pel tutor: nin.crg.es/cgi-bin/pMargeWeb.cgi.

Primer de tot, vam identificar les mostres corresponents a cada estadi i vam crear tres arxius: Ta-T1, T1-T2 i Ta-T2. A partir d'aquí obtinguérem els valors de p-value, el quals ens indiquen la significància de l'expressió diferencial en cada estadi. En el nostre estudi, seleccionàrem els gens amb p-values inferiors a 0,001 (p<0,001). Aquest càlcul el vam fer en una fulla Excel seguint el procediment:

Cerca del "Gene Symbol". Amb el programa EASE, a partir dels identificadors dels gens obtenim els "gene symbols" que posteriorment ens seran útils per analitzar els resultats.

El programa EASE l'hem baixat de la web de DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), hem introduït els identificadors dels gens a "Input Genes" i hem clicat a Annotate Genes. Amb aquest procediment hem obtingut informació diversa com el "gene symbol", funcionalitat, localització cromosòmica...

Agrupaments. Una de les eines més freqüentment emprades en l'anàlisi de la informació procedent dels bioxips és l'anàlisi per "clustering", on s'agrupen els gens o experiments en funció dels patrons que presenten les diferents mostres. Els mètodes de "clustering" poden ser:

• Jeràrquics
  • Aglomeratiu
  • Genera arbre jeràrquic
  • Simple
  • Representació fàcil de visualitzar amb Tree View
• Basats en K-means
  • Divisiu
  • Parteix d'un nombre predeterminat de grups de gens o condicions
  • Calcula un vector d'expressió promig que es va refinant per càlcul reiteratiu
  • No produeix arbres
• SOMs (Self Organizing Maps)
  • Divisiu
  • Basat en xarxes neuronals (mètodes de computació auto-entrenants)
  • Optimitza la separació de grups en base a geometria predefinida sobre la qual s'entrenen vectors de referència.
  • Maximitza la convergència entre vectors i punts de cada cluster

En el nostre treball hem fet servir clustering jeràrquic. Primer de tot, vam accedir a la pàgina de GEPAS (Gene_Expression_Pattern_Analysis_Suite). Entràrem a:

Les funcions seleccionades foren: Log-transform en base 2 (recordem que shan de treure els valors negatius dels arxius als quals els vam assignar un valor de 10) i Standardize patterns. Això permet normalitzar les dades.

A continuació, per visualitzar l'arbre cliquem a send to cluster. La condició de Cluster que và posar són: UPGMA using correlation distance .

Funcionalitat dels gens.Per trobar informació tant de la funcionalitat com de processos biològics en els quals estan implicats els gens seleccionats vam utilitzar dues fonts:

• DAVID. Dins d'aquesta web clicàrem a GOCharts i posàrem els identificadors GenBank. El GoChart és una eina que ens permet visualitzar gràficament la distribució dels gens diferencials en base a la seva funció. Dels tres tipus de classificació que ens ofereix aquest programa, seleccionàrem els processos biològics i la funció mol.lecular. Pel que fa a l'especificitat escollirem la màxima (nivell 5) i com a hits mínims, 3 (malgrat en el cas de T1-T2 que, al haver-hi un baix nombre de gens, en vam seleccionar 1).
• FatiGO. En primer lloc definim l'organisme: human, escollim funció molecular i posem la llista de gens. Obtenim els gràfics amb les funcions més representatives.

A continuació per tal d'obtenir informació detallada de les funcions dels gens seleccionats, podem fer servir la web del NCBI

Obtenir els Representative mRNA Access. Anem a la web de SOURCE i introduïm la llista d'identificadors per tal d'aconseguir una nomenclatura gènica equivalent i poder comparar i analitzar els resultats.

Comparar dades. En el pas anteior hem obtingut arxius amb dues columnes, una amb els identificadors i l'altra amb els Representative mRNA Access corresponents. Per comparar els nostres resultats amb els de l'article necessitem fitxers on únicament tinguem un tipus d'identificador. Per això, hem realitzat les següents comandes en Shell (Unix):

A continuació ordenem les diferents llistes de gens i amb la comanda uniq agrupem els repetits per tal d'evitar sobreestimacions:

Per últim, per veure si hi ha gens coincidents entre els diferents estadis estudiats i l'article mencionat emprem les següents comandes:

Gens diferencialment expressats en la progressió Ta-T2:

Com podem comprovar en les taules anteriors, els gens que nosaltres hem seleccionat com a més significatius tenen una funcionalitat similar als dels dos articles comentats. Així doncs, podem veure gens típicament relacionats amb els processos tumorals com la pèrdua d'adhesió, que estaria involucrada en processos de metàstasi; gens, la repressió dels quals, suposaria una pèrdua en l'eficàcia del sistema immune. També es veu alterat el metabolisme lipídic i, com era d'esperar, observem desregulació en el procés de la transcripció amb la conseqüent afectació del cicle cel.lular.